等度洗脫是指實驗過程中(做樣過程)從頭到尾只用一種流動相。也就是只用一個泵，輸送同一種流動相。
梯度洗脫是指在同一個分析周期中隨著時間的變化按一定程序梯度性地改變洗脫液的比例(濃度配比、成 分、離子強度、溶液極性等)或pH，以期將層析柱上不同的組分洗脫出來的方法。從而可以使一個復(fù)雜樣品中性質(zhì)(極性)差異較大的組分能按各自適宜的容量因 子k達(dá)到良好的分離目的。梯度洗脫一般分為二元高壓梯度，二元低壓梯度和四元低壓梯度；二元高壓梯度需要兩臺高壓泵，二元低壓梯度和四元低壓梯度都是只需 要一臺高壓泵和一個比列閥。
配置特點：
1. 等度洗脫只需要配置一臺高壓泵，配置相對簡單，成本低；
2. 二元高壓梯度洗脫需要配置兩臺高壓泵，一個混合器及連接管理，配置較高，成本高；
3. 二元低壓梯度洗脫需要配置一臺高壓泵、一個二元比例閥、一臺在線脫氣機(jī)、一個混合器(脫氣機(jī)和混合器視情況而定，可不選)及連接管路，配置較低，成本較低；
4. 四元低壓梯度洗脫需要配置一臺高壓泵、一個四元比例閥、一臺在線脫氣機(jī)、一個混合器(視情況而定，可不選)及連接管路，配置較高，成本較低。
梯度洗脫配置相對復(fù)雜，現(xiàn)主要介紹下梯度洗脫的原理及洗脫要求：
梯度洗脫的原理
具體地講，當(dāng)樣品隨梯度起點的流動相進(jìn)入色譜柱入口時，由于起點流動相中弱洗脫溶劑A含量較高，強洗脫溶劑B含量較低，化合物C1(保留性適中)和化合物C2(保留較強)因分配系數(shù)(k值)較高而滯留于色譜柱入口附近，幾乎未移動。一段時間后，B增加到一定數(shù)值，C1的k值達(dá)到足夠小(比如小于10)，其在柱中的移動速率明顯增大，并且隨著B的增加，其移動速率愈加快速，直到tC1時流出色譜柱，被檢測器檢測到并被記錄成色譜峰C1，tC1雖然比等度時的保留時間長很多，但C1的的平均k值卻很小，因而色譜峰并未展寬，靈敏度仍處于較高水平。B持續(xù)增加，在隨后的某個時間點，C2的k值也降到10以下，C2的移動速率也開始變快，以與C1類似的方式于tC2被洗脫出色譜柱，其平均k值同樣很小，色譜峰亦未展寬，靈敏度處于較高水平。
流動相的梯度變化即流動相極性、PH值等的梯度變化，即洗脫能力成梯度變化。
洗脫要求
① 洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使各峰*或基本分離；
② 梯度的上限(強洗脫溶劑的比例)要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來。
③ 梯度不要上升太快，要恰好使移動的區(qū)帶在快到柱末端時達(dá)到解吸狀態(tài)。目的物的過早解吸，會引起區(qū)帶擴(kuò)散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
優(yōu)缺點：
1.等度洗脫優(yōu)點：流速不發(fā)生變化，壓力穩(wěn)定，實驗結(jié)果準(zhǔn)確、可靠；
缺點：多組分檢測或有雜質(zhì)干擾情況下分離度可能會差，而且不容易優(yōu)化，對于某些復(fù)雜樣品分析時間長，峰形差。
2.二元高壓梯度洗脫優(yōu)點：每臺泵的流速都由程序控制，a.多組分檢測或有雜質(zhì)干擾情況下提高分離能力，b.縮短某些復(fù)雜樣品的分析時間，c.改善峰形，減少拖尾，d.提高柱效，增加檢測靈敏度；
缺點：a.流 速變化得由程序控制，有時會出錯,b.壓力可能會不穩(wěn)定，c.混合時可能會產(chǎn)生氣泡，影響基線噪聲及漂移，d.高壓混合時可能會產(chǎn)生熱量，e.對混合器要 求很高，如果混合不好，基線噪聲和漂移會很大，f.由于流動相比例發(fā)生變化，基線可能會漂移，g.實驗準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性沒有等度高，h.故障率高于等度。
3.二元低壓梯度優(yōu)點：只需一臺泵一個比例閥，就能達(dá)到梯度洗脫效果；
缺點：低壓混合可能會產(chǎn)生氣泡，梯度穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度不高。
4.四元低壓梯度優(yōu)點：只需一臺泵和一個比列閥，就能達(dá)到梯度洗脫效果，并且同時可以控制四種流動相；
缺點：低壓混合可能會產(chǎn)生氣泡，需要加在線脫氣機(jī)，梯度穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度不高，對比列閥要求很高，梯度滯后體積大。
檢測要求：不同物質(zhì)(所測物質(zhì))分離度一定要好，峰形要好，分析時間要短，穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度盡量高，實驗成本盡量低等等。
配置建議：
1.采樣液相色譜法實驗時，對儀器的配置一般盡量簡單。儀器配置復(fù)雜后，操作就會復(fù)雜，穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度可能會受影響，故障率就會高，使用成本也會高。在能達(dá)到較好的分離度及峰形的情況下能用等度就用等度；
2.同時檢測多種復(fù)雜成分，或是有干擾物的情況下，為達(dá)到滿意的峰形、分離度、分析時間，就得使用梯度洗脫方式了。各種成分可以使用不同比例的流動相進(jìn)行洗脫，如農(nóng)殘檢測、氨基酸檢測等。要求高的話采用高壓梯度洗脫，要求低的話采用低壓梯度洗脫。
3.流動相種類相對簡單的話采用二元低壓梯度洗脫，相對復(fù)雜的話(如洗脫時需要四種不同溶液的流動相)采用四元低壓梯度洗脫
